BIOCHIMICA APPLICATA

Conferire conoscenze ed acquisire competenze relative ai fondamenti logici delle varie metodologie e tecniche strumentali coinvolte nella sperimentazione biochimica e biomolecolare. Fornire gli strumenti cognitivi per seguire gli sviluppi della genetica molecolare e dei relativi protocolli per l'identificazione, il clonaggio con i suoi vettori, il sequenziamento e l'espressione genica che hanno rivoluzionato la conoscenza dei processi biologici a livello molecolare, contribuendo al carattere interdisciplinare del corso.

Saranno effettuate lezioni frontali. Sono previste esercitazioni teorico-pratiche e seminari di approfondimento. Qualora l'insegnamento venisse impartito in modalità mista o a distanza potranno essere introdotte le necessarie variazioni rispetto a quanto dichiarato in precedenza, al fine di rispettare il programma previsto e riportato nel syllabus.

Conoscenze di base di Biochimica, Biologia Molecolare e Chimica Fisica.

Obbligatoria (almeno al 70 % delle lezioni), in rispetto delle norme del Regolamento didattico d’Ateneo e del Corso di Studio.

Principi della ricerca biochimica. Preparazione e manipolazione di campioni biologici. Uso e preparazione di soluzioni tampone. Rottura di cellule; preparazione e purificazione di organelli cellulari; centrifugazione: centrifughe, rotori, centrifugazione differenziale e di isodensità all'equilibrio con esempi applicativi (separazione di organelli cellulari, purificazione di acidi nucleici).

Modelli di sperimentazione biologica: Animale intero, organi perfusi, sezioni di tessuto. Soluzioni tampone. Colture cellulari. Il laboratorio per colture di cellule. Sterilizzazione. Metodiche colturali: colture primarie, secondarie, linee cellulari. Medium di coltura. Separazione ed analisi delle popolazioni di cellule. Conta cellulare. Crio-conservazione. Citometria a flusso, FACS e MACS.

Tecniche microscopiche. Microscopio ottico. Sezionamento ottico. Imaging di cellule e tessuti viventi.Stereomicroscopio. Imaging e biochimica. Tecniche specializzate di imaging.

Tecniche elettroforetiche: Principi generali. Elettroforesi zonale su acetato di cellulosa; proteine sieriche. Elettroforesi su gel: agarosio, poliacrilamide gel elettroforesi (PAGE e SDS-PAGE). Isoelettrofocalizzazione (IEF). Elettroforesi bidimensionale (applicazioni allo studio del proteoma). Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative (colorazioni “in gel” e in seguito a blotting). Elettroforesi capillare.

Tecniche cromatografiche per la purificazione, separazione, identificazione e analisi quantitativa di molecole a basso (metaboliti, farmaci, ormoni, etc.) ed elevato (acidi nucleici e proteine) PM: Principi generali. Cenni sulla TLC. Cromatografia a scambio ionico. Cromatografia ad esclusione, Cromatografia di affinità. HPLC e GC (fasi stazionarie, rivelatori e principali applicazioni).

Spettrofotometria UV-Visibile: Richiami sulla natura delle radiazioni elettromagnetiche. Spettrofotometria UV-VIS (principi, strumentazione ed applicazioni). Spettri di assorbimento. Legge di Lambert-Beer e sue applicazioni quantitative. Concetto di retta di calibrazione. Dosaggio spettrofotometrico della concentrazione proteica. Applicazione della spettrofotometria nei dosaggi enzimatici.

Spettrofluorimetria (principi generali e applicazioni) e Chemiluminescenza. Citofluorimetria a flusso e “cell sorting”. Cenni di Luminometria.

Tecniche immunochimiche. Struttura degli anticorpi, reazione antigene-anticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali. Metodi di analisi: reazione di immunoprecipitazione in fase libera ed in gel, immunodiffusione; metodi radioimmunologici: RIA ed IRMA; dosaggi immunoenzimatici: EMIT, ELISA e PEIA. Dosaggi ormonali: metodiche e applicazioni.

Tecniche elettrochimiche. Elettrodo ad ossigeno; studi sulla respirazione mitocondriale. Biosensori.

Metodi radioisotopici. Principi, strumentazione ed applicazioni. Richiami sui tipi di decadimento radioattivo. Energia e velocità del decadimento radioattivo. Rivelazione e misura della radioattività. Efficienza di conteggio e quenching. Autoradiografia. Applicazioni dei radioisotopi in biochimica. Applicazione dei radioisotopi nell'analisi clinica.

Tecniche di spettrometria di massa per l’analisi qualitativa e quantitativa di molecole a basso (metaboliti, farmaci, ormoni, etc.) ed elevato (acidi nucleici e proteine) peso molecolare. Principi generali e strumentazione (sorgenti e analizzatori).

Tecniche per lo studio delle proteine: metodi per il sequenziamento, la determinazione della struttura secondaria e terziaria, e delle modificazioni post-traduzionali e mutazioni. Cenni di proteomica.

Metodi di marcatura di molecole biologiche: Richiami sui tipi di decadimento radioattivo. Energia e velocità del decadimento radioattivo. Rivelazione e misura della radioattività mediante scintillazione. Autoradiografia. Marcatura con sistemi non radioattivi.

Generalità sugli acidi nucleici. Manipolazione degli acidi nucleici: strumenti e tecniche di base. Isolamento di DNA e RNA. Estrazione automatizzata mediante kit degli acidi nucleici. Elettroforesi degli acidi nucleici. Analisi automatizzata dei frammenti di acidi nucleici. Elementi di bioinformatica.

Tecniche di biologia molecolare. Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali. Reazione a Catena della Polimerasi (PCR): principi e applicazioni diagnostiche. Identificazione di specifiche sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione di Southern (Southern blotting) e applicazioni nella diagnosi di malattie genetiche. Northern blotting e applicazioni nello studio dell'espressione genica. Valutazione dell'espressione genica: la tecnica del DNA microarray.

Il corso include esercitazioni pratiche in laboratorio obbligatorie su alcuni degli argomenti trattati nel corso.

Wilson K., Walzer J.: Biochimica e biologia molecolare: principi e tecniche. Ed. Raffaello Cortina Editore.

Ninfa A.J., Ballou D.P.: Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Ed. Zanichelli.

D.L. Nelson, M.M. Cox: I Principi di Biochimica di Lehninger, VII Edizione 2018, Ed. Zanichelli.

3. Voet D., Voet J.V., Pratt C.W. Fondamenti di Biochimica. Edizione IV. Ed. Zanichelli.

La verifica dell'apprendimento è costituita da una prova orale. La verifica dell’apprendimento potrà essere effettuata anche per via telematica, qualora le condizioni lo dovessero richiedere.

Per gli studenti frequentanti il corso è prevista una prova di verifica in itinere con domande a risposte aperte. La prova, superato il punteggio minimo di 18/30, concorrerà alla valutazione finale.

La valutazione finale (voto d’esame) verrà effettuata in base alla pertinenza delle risposte rispetto alle domande formulate, alla qualità dei contenuti, alla capacità di collegare gli argomenti oggetto del programma, alla capacità di formulare esempi, alla proprietà di linguaggio tecnico e alla capacità espressiva complessiva dello studente.

1. Colture cellulari. Tecniche elettroforetiche. Principi di base della fluorescenza. Tecniche di silenziamento genico. PCR.

2. Microscopio a fluorescenza e a scansione laser confocale. Citofluorimetro. MALDI e MALDI-TOF. HPLC. Western Blot.

3. Cellule staminali. Produzione di anticorpi policlonali e monoclonali. Tecniche di clonaggio. Proteine terapeutiche. ELISA.