BIOCHIMICA APPLICATA

Conferire conoscenze ed acquisire competenze relative ai fondamenti logici delle varie metodologie e tecniche strumentali coinvolte nella sperimentazione biochimica e biomolecolare. Fornire gli strumenti cognitivi per seguire gli sviluppi della genetica molecolare e dei relativi protocolli per l'identificazione, il clonaggio con i suoi vettori, il sequenziamento e l'espressione genica che hanno rivoluzionato la conoscenza dei processi biologici a livello molecolare, contribuendo al carattere interdisciplinare del corso.

Conoscenze di base di Chimica fisica e di Biochimica.

Obbligatoria.

Principii della ricerca biochimica. Preparazione e manipolazione di campioni biologici. Uso e preparazione di soluzioni tampone. Rottura di cellule; preparazione e purificazione di organelli cellulari; centrifugazione: centrifughe, rotori, centrifugazione differenziale e di isodensità all'equilibrio con esempi applicativi (separazione di organelli cellulari, purificazione di acidi nucleici).

Modelli di sperimentazione biologica: Animale intero, organi perfusi, sezioni di tessuto. Soluzioni tampone. Colture cellulari. Il laboratorio per colture di cellule. Sterilizzazione. Metodiche colturali: colture primarie, secondarie, linee cellulari. Medium di coltura. Separazione ed analisi delle popolazioni di cellule. Conta cellulare. Crio-conservazione. Citometria a flusso, FACS e MACS.

Tecniche elettroforetiche: Principi generali. Elettroforesi zonale su acetato di cellulosa; proteine sieriche. Elettroforesi su gel: agarosio, poliacrilamide gel elettroforesi (PAGE e SDS-PAGE). Isoelettrofocalizzazione (IEF). Elettroforesi bidimensionale (applicazioni allo studio del proteoma). Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative (colorazioni “in gel” e in seguito a blotting). Elettroforesi capillare.

Tecniche cromatografiche per la purificazione, separazione, identificazione e analisi quantitativa di molecole a basso (metaboliti, farmaci, ormoni, etc.) ed elevato (acidi nucleici e proteine) PM: Principi generali. Cenni sulla TLC. Cromatografia a scambio ionico. Cromatografia ad esclusione, Cromatografia di affinità. HPLC e GC (fasi stazionarie, rivelatori e principali applicazioni).

Spettrofotometria UV-Visibile: Richiami sulla natura delle radiazioni elettromagnetiche. Spettrofotometria UV-VIS (principi, strumentazione ed applicazioni). Spettri di assorbimento. Legge di Lambert-Beer e sue applicazioni quantitative. Concetto di retta di calibrazione. Dosaggio spettrofotometrico della concentrazione proteica. Applicazione della spettrofotometria nei dosaggi enzimatici.

Spettrofluorimetria (principi generali e applicazioni) e Chemiluminescenza. Citofluorimetria a flusso e “cell sorting”. Cenni di Luminometria.

Tecniche immunochimiche. Struttura degli anticorpi, reazione antigene-anticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali. Metodi di analisi: reazione di immunoprecipitazione in fase libera ed in gel, immunodiffusione; metodi radioimmunologici: RIA ed IRMA; dosaggi immunoenzimatici: EMIT, ELISA e PEIA. Dosaggi ormonali: metodiche e applicazioni.

Tecniche elettrochimiche. Elettrodo ad ossigeno; studi sulla respirazione mitocondriale. Biosensori.

Metodi radioisotopici. Principi, strumentazione ed applicazioni. Richiami sui tipi di decadimento radioattivo. Energia e velocità del decadimento radioattivo. Rivelazione e misura della radioattività. Efficienza di conteggio e quenching. Autoradiografia. Applicazioni dei radioisotopi in biochimica. Applicazione dei radioisotopi nell'analisi clinica.

Tecniche di spettrometria di massa per l’analisi qualitativa e quantitativa di molecole a basso (metaboliti, farmaci, ormoni, etc.) ed elevato (acidi nucleici e proteine) peso molecolare. Principi generali e strumentazione (sorgenti e analizzatori).

Tecniche per lo studio delle proteine: metodi per il sequenziamento, la determinazione della struttura secondaria e terziaria, e delle modificazioni post-traduzionali e mutazioni. Cenni di proteomica.

Metodi di marcatura di molecole biologiche: Richiami sui tipi di decadimento radioattivo. Energia e velocità del decadimento radioattivo. Rivelazione e misura della radioattività mediante scintillazione. Autoradiografia. Marcatura con sistemi non radioattivi.

Tecniche di biologia molecolare. Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali. Reazione a Catena della Polimerasi (PCR): principi e applicazioni diagnostiche. Identificazione di specifiche sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione di Southern (Southern blotting) e applicazioni nella diagnosi di malattie genetiche. Northern blotting e applicazioni nello studio dell'espressione genica. Valutazione dell'espressione genica: la tecnica del DNA microarray.

Il corso include esercitazioni pratiche in laboratorio obbligatorie su alcuni degli argomenti trattati nel corso.

Wilson K., Walzer J.: Biochimica e biologia molecolare: principi e tecniche. Ed. Raffaello Cortina Editore.

Ninfa A.J., Ballou D.P.: Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Ed. Zanichelli.

D.L. Nelson, M.M. Cox: I Principi di Biochimica di Lehninger, Ed. Zanichelli.

D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt: Fondamenti di Biochimica, Ed. Zanichelli.

Orale.